Возврат к списку

Цифровое пространственное профилирование GeoMx DSP — анализ транскриптомов

Понимание неоднородности тканей имеет решающее значение для ответа на ключевые биологические вопросы в трансляционных исследованиях. Нынешняя парадигма анализа тканей требует компромисса между морфологическим и молекулярным высокомультиплексным анализом, жертвуя ценной информацией или потребляя ценные образцы. В медицинской практике все больше уделяется внимания проектам, связанным с генетикой и онкологией, так как это открывает новые возможности для диагностики и лечения различных заболеваний. Качество каждой медицинской услуги в наше время зависит от использования современных научных подходов и инструментов в биологии и генетике. Цифровое пространственное профилирование GeoMx DSP – уникальная разработка 2019 года не имеющая аналогов, которая позволяет проводить количественный анализ экспрессии множества генов (до полного транскриптома) и белков на стекле в выбранном участке. 

Для полного транскриптома генов путем секвенирования важным этапом в получении информации является подготовка библиотек на основе исходного материала – РНК после удаления рибосомальной РНК или обогащения поли-А+. Эти библиотеки специально разработаны для таких задач, как подготовка стандартных РНК-библиотек, покрывающих всю длину мРНК для проведения sense mRNA-seq. В состав наборов для получения библиотек входят все необходимые компоненты, которые гарантируют точность и эффективность секвенирования. Технология замещения цепи stop/ligation используется при создании библиотек с помощью этих наборов, обеспечивая высокое качество и надежность полученных данных. Таким образом, анализ полного транскриптома с использованием этих библиотек позволяет получить результат с информацией о всей генетической активности в исследуемой системе.

Выбор области интереса можно проводить различным образом: геометрически – обвести область интереса фигурой, сегментно – выбрать только области генов, в которых связалась та или иная флуоресцентная метка, контурно – отметив слои или контуры вокруг различных участков, сеточно – настроив параметры сетки или просто отметив единичные клетки.

Основные преимущества технологии исследования единичных клеток:

• Высокая мультиплексность – количество до 800 мишеней при работе в комбинации c системой nCounter, до полного транскриптома генов при работе с системами высокопроизводительного секвенирования (NGS)
• Минимальное количество образца - один срез для анализа РНК или белков в гене
• 4-ех цветная визуализация для определения морфологического контента
• Возможен повторный анализ слайдов при работе с белками
• Настраиваемая разрешающая способность – выбор участка интереса от 600 микрон до единичной клетки
• Высокая пропускная способность – до 20 срезов в день
• Количественный подсчет мишеней

Адаптация технологии NanoString для количественного анализа белков

В результате растущего интереса к гетерогенности опухолей и редких клеточных подгрупп (например, циркулирующих опухолевых клеток) высокочувствительный метод, позволяющий профилировать несколько клеток или даже отдельные единичные клетки с высоким уровнем мультиплексирования, вызывает все больший интерес. Штрих-кодирование гена ДНК было разработано и применено к растворимым белкам [2-7]. Тем не менее, применение технологии к единичным клеткам или клеточным суспензиям было ограничено из-за сложностей обнаружения и амплификации штрих-кода в клеточной микросреде. Эти ограничения были первоначально превзойдены развитием свето-опосредованного клеточного штрих-кодирования (LCMB). Agasti и соавторы [8] разработали метод протеомного профилирования на основе антител, который позволял обнаруживать белки в суспензиях живых клеток с помощью антител, конъюгированных с уникальными олигомерами ДНК, через линкер, расщепляемый под воздействием ультрафиолета. Эксперименты продемонстрировали линейную корреляцию олигонуклеотидов, отделившихся от антитела против HER2, к количественной оценке клеток SK-BR3, 3T3 и MDA-MB-231 на основе проточной цитофлуориметрии. Было показано обнаружение отдельных клеток SK-BR3 в экспериментах с разведением и обнаружение EGFR, EpCAM и HER2 / neu, которые можно получить при мультиплексном окрашивании линий клеток рака молочной железы.

В то время LMCB был значительным прогрессом, метод был полуколичественным, и амплификация с помощью ПЦР освобожденных олигонуклеотидов ограничивала мультиплексирование до 5 мишеней и приводила к сдвигам. Метод ПЦР для анализа освобожденных олигонуклеотидов был впоследствии заменен на метод NanoString [9]. Детектирование олигонуклеотидов системой nCounter устранило необходимость проведения амплификации и увеличило количество одновременно анализируемых мишеней. Эксперименты по белковому профилированию продемонстрировали обнаружение до 90 белков в свежих и замороженных биопсийных образцах. Дальнейшая валидация показала сравнимые результаты с окрашиванием коньюгированными и неконьоюгированными антителами, воспроизводимось, идентичность окрашивания против индивидуальных маркеров и окрашиванием коктейлем против 60 аналитов , высокую корреляцию с уровнем экспрессии 6 маркеров (CD44, HER2, EGFR, CA19-9, CK7, MUC1) полученных методом проточной цитофлуориметрии. Метод конъюгации антител был впоследствии адаптирован компанией NanoString, которая разработала специализированный прибор для визуализации образцов ткани и отбора проб с выбранных пользователем участков для последующего анализа на приборах nCounter и SPRINT – Система цифрового пространственного профилирования GeoMx Digital Spatial Profiler.

Весь протокол состоит из 6 шагов (описан протокол при анализе экспрессии белков):

1. Окраска слайда антителами, конъюгированными с олигонуклеотидами через линкер, расщепляемый под воздействием ультрафиолета
2. Выбор интересующих областей интереса (Regions of Interests – ROI): геометрически выбранная область, фенотипически выбранная область, единичная/единичные клетки
3. Облучение заданной области и отщепление олигонуклеотидов
4. Захват олигонуклеотидов с помощью микрокапилляра и распределение в планшет
5. Подсчет и анализ экспрессии

Система цифрового пространственного профилирования может работать как со свежими тканями, так и зафиксированными тканями, заключенными в парафин (FFPE)
Химическая и техническая сложность платформы GeoMx предполагает необходимость надежной проверки ее данных: технических характеристик, чувствительности и воспроизводимости. Исследования показали, что технология имеет больший динамичесмких диапазон чем ИГХ, обладает высокой воспроизводимостью и хорошо коррелирует с методами «золотой стандарт». Более подробно обо всей технической валидации и возможностях системы в исследовании «New tools for pathology: a user’s review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue» Jérémie Decalf , Matthew L. Albert , James Ziai [1]

Система позволяет анализировать большое число маркеров при небольшом количестве материала. Так в исследованиях 2018 года сотрудниками Netherlands Cancer Institute производилась оценка экспрессии белков биопсийного материала меланомы для понимания иммунного статуса и оценке потенциального ответа на терапию. Данные показали, что инфильтрация иммунными клетками коррелирует с ответом на терапию [10] Группа из MD Anderson Cancer Center также занимались поиском маркеров при меланоме, которые бы показали ответ на терапию ниволумабом (nivolumab) или комбинации ниволумаба (nivolumab) и ипилимимаба (ipilimumab). Технология позволила группе количественно измерить экспрессию белков в частности в ин фильтрующих опухоль иммунных клетках до и вовремя лечения в образцах тонкоигольной биопсии. Благодаря технологии было выявлено, что наличие популяций иммунных клеток и их активационный статус могут прогнозировать клинический ответ на терапию [11]. С целью определения механизмов взаимодействия между генетическими структурами, ученые изучают профиль генома в разных условиях жизни человека. В ходе изучения генома ученые обнаруживают различные механизмы связи между генетическими структурами, что помогает определить наиболее эффективные методы исследования.

На данный момент доступны для заказа:

1) Готовые белковые панели:

2) РНК панель для работы с системами nCounter

3) РНК панели для работы с системами высокопроизводительного секвенирования NGS

Также, компания активно работает в сторону создания набора для пришивания олигонуклеотидов к антителам, что позволит создавать пользовательские белковые панели непосредственно в лаборатории.

Программное обеспечение GeoMx DSP предоставляет собой комплексное программное решение от сбора изо¬бражений, выбора области интереса до полностью интегрированного анализа данных.

На момент августа 2020 года опубликовано 36 статьей с использованием вышеописанной технологии, не смотря на новизну и официальный анонс только в конце 2019 года. Полный список публикаций https://www.nanostring.com/scientific-content/publications/filterPub/202?filterCategory=59&filterYear=all&filterKeyword=

Современные научные инструменты в генетике и биологии позволяют проводить исследование единичных клеток с высокой точностью. Этот подход является ключевым в медицинской науке, так как метод позволяет выявлять новые мутации, процессы и качества каждой клетки пациентов. Секвенирование генетического материала является центральным проектом в медицинской генетике и онкологии. Эти данные используются для разработки новых методов лечения заболеваний и формирования политики в медицине. Научный подход к исследованию единичных клеток открывает новые возможности в понимании процессов развития и лечения различных заболеваний.

Используемая литература

1. «New tools for pathology: a user’s review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue» Jérémie Decalf , Matthew L. Albert , James Ziai
2. Nam JM. Nanoparticle-based bio-bar codes for the ultrasensitive detection of proteins. Science; 2003; 301: 1884–1886. 18. Bao YP, Wei T-F, Lefebvre PA, et al.
3. Detection of protein analytes via nanoparticle-based bio bar code technology. Anal Chem 2006; 78: 2055– 2059.
4. Wacker R, Ceyhan B, Alhorn P, et al. Magneto Immuno-PCR: a novel immunoassay based on biogenic magnetosome nanoparticles. Biochem Biophys Res Commun 2007; 357: 391–396.
5. Fredriksson S, Dixon W, Ji H, et al. Multiplexed protein detection by proximity ligation for cancer biomarker validation. Nat Methods 2007; 4: 327–329.
6. Sano T, Smith CL, Cantor CR. Immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates. Science; 1992; 258: 120– 122.
7. Hendrickson ER, Truby TMH, Joerger RD, et al. High sensitivity multianalyte immunoassay using covalent DNA-labeled antibodies and polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res 1995; 23: 522–529.
8. Agasti SS, Liong M, Peterson VM, et al. Photocleavable DNA barcodeantibody conjugates allow sensitive and multiplexed protein analysis in single cells. J Am Chem Soc 2012; 134: 499–502
9. Ullal AV, Peterson V, Agasti SS, et al. Cancer cell profiling by barcoding allows multiplexed protein analysis in fine-needle aspirates. Sci Transl Med 2014; 6: 219ra9.
10. Amaria RN, Reddy SM, Tawbi HA, et al. Neoadjuvant immune checkpoint blockade in high-risk resectable melanoma. Nat Med 2018; 24(11): 1649–54.
11. Blank CU, Rozeman EA, Fanchi LF, et al. Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma. Nat Med 2018; 24: 1655–1661