Возврат к списку

Секвенирование

Классическим методом секвенирования считается секвенирование по Сэнгеру, или секвенирование c обрывом цепи. Принцип работы этого метода заключается в прекращении синтеза цепи при включении в последовательность дидезоксинуклеотидов, завершающих цепь (ddNTP). У ddNTP отсутствует 3’OH-группа, поэтому фосфодиэфирные связи между нуклеотидами образоваться не могут и синтез цепи ДНК прекращается. После завершения синтеза на капиллярный гель-электрофорез помещают все получившиеся фрагменты. В зависимости от размера они проходят гель с разной скоростью. К дидезоксинуклеотидам приклеплён флуоресцентный краситель и, после детекции флуоресценции, на хроматограмме фиксируется серия пиков интенсивности, по которой можно определить последовательность исходной ДНК.

Альтернативный способ расшифровки ДНК, широко применяемый в лабораторной диагностике и научно-исследовательской деятельности, это секвенирование нового поколения (NGS). Метод NGS отличается высокой скоростью исследования и большим объёмом получаемых данных, поскольку секвенирование происходит одновременно для тысяч молекул ДНК, в отличие от стандартной технологии секвенирования по Сэнгеру.

В системах NGS используются четыре основных метода секвенирования ДНК:

• пиросеквенирование

• секвенирование путем синтеза

• секвенирование путем лигирования

• ионное полупроводниковое секвенирование

Самым распространённым из них является метод секвенирования путём синтеза, реализованный компанией Illumina. Проведение секвенирования включает в себя следующие этапы: подготовка библиотек, секвенирование и анализ данных. Подготовка библиотек состоит так же из нескольких этапов - фрагментации ДНК и присоединения адаптеров (синтезированных олигонуклеотидов с известной последовательностью). Адаптеры обеспечивают связывание фрагментов ДНК с подложкой и обеспечивают идентификацию образцов, что необходимо при одновременном секвенировании нескольких образцов.

После связывания фрагмента ДНК с подложкой, происходит многократное копирование этого фрагмента. Таким образом, на поверхности подложки формируются кластеры, содержащие только одинаковые копии. Этот процесс необходим, чтобы получать сигнал от группы молекул, поскольку результат считывания такого сигнала точнее. Фрагменты ДНК в кластерах – одноцепочечные, в процессе секвенирования, происходит синтез комплиментарной цепи. Присоединяющиеся нуклеотиды связаны с флуоресцентным красителем определённого цвета. В процессе синтеза цепи подложку освещают лазером и фиксируют сигнал от красителя. Полученную последовательность сигналов затем переводят в последовательность нуклеотидов.

Благодаря высокой производительности и чувствительности метода, NGS широко применяется в практической медицине и является на данный момент наиболее информативным методом молекулярно-генетической диагностики в клинической онкологии.

В настоящее время появилась возможность проводить как полногеномные и полноэкзомные исследования, так и использовать таргетные панели. Панели для секвенирования нового поколения позволяют одновременно исследовать большое количество генов, что является ещё одним важным преимуществом метода NGS. Мультигенные панели могут быть использованы для поиска новых и редких соматических мутаций. Так, была обнаружена ранее не описанная в базах мутация в гене EGFR (Иванов и др., 2015).  Панели для секвенирования успешно применяются для обнаружения герминальных мутаций при различных видах рака (Maani, N et al.,2021). Роль мультигенных панелей для диагностики наследственной предрасположенности к раку была показана при исследовании пациентов с клиническими анамнезами, содержащими несколько возможных диагнозов и пациентов с анамнезами, не отвечающими диагностическим критериям конкретного наследственного онкологического синдрома (LaDuca H et al., 2014). Так же NGS панели использовались в исследовании группы пациентов с диагнозом рак желудка (Немцова и др., 2015). В этом исследовании у пациентов были обнаружены герминальные мутации не ассоциированных с раком желудка, но, с большой вероятностью, имеющие отношение к его развитию и увеличивающих вероятность возникновения рецидива.

Использование панелей для секвенирования позволяет снизить себестоимость анализа, увеличить его производительность и упростить обработку и интерпретацию полученных данных. Такие генетические тесты являются диагностическими и прогностическими факторами в клинической онкологии и играют важную роль при выборе тактики лечения для каждого пациента.

Используемая литература:

1. Erwin L. van Dijk, Hélène Auger, Yan Jaszczyszyn, Claude Thermes. (2014). Ten years of next-generation sequencing technology. Trends in Genetics. 30, 418-426;
2. Z. Ma, R. W. Lee, B. Li, P. Kenney, Y. Wang, et. al.. (2013). Isothermal amplification method for next-generation sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 14320-14323;
3. Wang M., Sun X., Yu D., Xu J., Chung K., Li H. (2016). Genomic and transcriptomic analyses of the
4. Donald Sharon, Hagen Tilgner, Fabian Grubert, Michael Snyder. (2013). A single-molecule long-read survey of the human transcriptome. Nat Biotechnol. 31, 1009-1014;
5. Jonas Korlach, Arek Bibillo, Jeffrey Wegener, Paul Peluso, Thang T. Pham, et. al.. (2008). Long, Processive Enzymatic DNA Synthesis Using 100% Dye-Labeled Terminal Phosphate-Linked Nucleotides. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 27, 1072-1082;
6. L. Orlando, A. Ginolhac, M. Raghavan, J. Vilstrup, M. Rasmussen, et. al.. (2011). True single-molecule DNA sequencing of a pleistocene horse bone. Genome Research. 21, 1705-1719
7. Иванов М.В., Новикова Е.И., Баранова А.В. и др. Опыт использования высокопроизводительного секвенирования (NGS) для подбора таргетной терапии при немелкоклеточном раке легкого: преимущества и ограничения. // Международный ежеквартальный научно-практический журнал по онкологии "Злокачественные опухоли". Москва. 2015. №4. С.310-311.
8. Keller A., Harz C., Matzas M. et al. Identification of novel SNPs in glioblastoma using targeted resequencing. // PLoS One. 2011. V. 6. N. 6 : e18158.
9.  Немцова М.В., Танас А.С., Алексеева Е.А. и др. Соматические и герминальные мутации при раке желудка. // Молекулярная медицина. 2015. №4. С.28-34.
10. Ozcelik H., Shi X., Chang M C. et al. Long-range PCR and next-generation sequencing of BRCA1 and BRCA2 in breast cancer. // J Mol Diagn. 2012. V. 14. N. 5. P. 467–475. 30.
11. Maani, N., Panabaker, K., McCuaig, J.M. et al. Incidental findings from cancer next generation sequencing panels. npj Genom. Med. 6, 63 (2021).
12. LaDuca H, Stuenkel AJ, Dolinsky JS, Keiles S, Tandy S, Pesaran T, Chen E, Gau CL, Palmaer E, Shoaepour K, Shah D, Speare V, Gandomi S, Chao E. Utilization of multigene panels in hereditary cancer predisposition testing: analysis of more than 2,000 patients. Genet Med. 2014 Nov;16(11):830-7.