Возврат к списку

Окраска по Папаниколау (Пап-тест)

Окраска по Папаниколау (ПАП-тест, Pap-тест) – скрининговый метод обследования цервикального канала и шейки матки для обнаружения потенциально предраковых и опухолевых процессов. Тест был изобретен Георгиосом Папаниколау и назван в его честь.

В 1923 году Папаниколау применил свой метод на женщинах, начиная с собственной жены[4], изучая физиологию половых функций и в дальнейшем диагноз рака матки.

Папаниколау получил американское гражданство в 1928 году и в том же году последовало его сообщение о методе[4]. Его первое сообщение об использовании цитологического метода, при диагнозе рака матки, в 1928 году было встречено с большим скептицизмом, поскольку господствующим тогда мнением было, что подобный диагноз возможен только при хирургическом вмешательстве.

Следующее сообщение Папаниколау опубликовал только в 1941 году, совместно с профессором гинекологии Herbert Traut[5]. Через 2 года последовала иллюстрированная монография (более 3 тыс. страниц), основанная на его исследовании.

Исследования Папаниколау затронули в дальнейшем цитологические изменения при раке шейки матки и свои заключения он опубликовал в 1943 году в специализированном издании под заголовком «Диагноз рака матки при помощи мазков» (англ. Diagnosis of Uterine Cancer by the Vaginal Smear). Публикация этих работ вызвала огромный интерес мирового медицинского сообщества и немедленное опытное использование метода в разных медицинских учреждениях.

Папаниколау своими работами стал основателем нового научного ответвления цитологии. Метод, получивший в его честь название (метод Папаниколау, тест Папаниколау, Пап-тест), открыл широкие горизонты в медицинских исследованиях половой физиологии и эндокринологии, в особенности, при диагностике рака

Метод окраски по Папаниколау позволяет оценить степень созревания цитоплазмы, хорошо окрашивает ядра с атипией. Образец для исследования может быть приготовлен как традиционным способом, так и методом жидкостной цитологии.

Метод окрашивания по Папаниколау является наилучшим для гинекологических мазков, так как этот метод полихромный, он позволяет оценить степень созревания цитоплазмы (от сине-зеленого цвета в незрелых клетках до розового в клетках со зрелой цитоплазмой и оранжевого в клетках с ороговением). Благодаря влажной фиксации хорошо сохраняются ядра, клеточная мембрана и структура хроматина. Краситель позволяет качественно дифференцировать степень созревания плоского эпителия и наличие патологического ороговения. Окрашивание Папаниколау контрастное, что дает качественную визуализацию клинически значимых элементов при микроскопии. Однако, методика довольно сложна и многостадийна: в процессе подготовки препарата, клетки ткани подвергаются воздействию различных красок и технологических жидкостей, окраска структурных составляющих препарата – ядра и, в особенности, цитоплазмы, многократно изменяется.

“Метод жидкостной цитологии с окраской по Папаниколау позволяет лучше диагностировать опухолеподобные и опухолевые процессы, с формулировкой по классификации Bethesda четких и кратких цитологических диагнозов, дающих врачу-эндокринологу или хирургу определить порядок дальнейших действий без сомнений¹”

Важно соблюдать протокол окрашивания, представленный производителем, поскольку краситель многокомпонентный и может быть представлен 4-компонентным набором, 3-х компонентным или комбинированным с различной спиртовой основой.

Методика окрашивания включает в себя попеременное окрашивание красителями:

1. Окраска гематоксилином Гарриса
2. Окраска в первой цитоплазматической краске OG6 (на основе красителя оранжевый G), быстро прокрашивающей цитоплазму всех клеток
3. Окраска в комбинированной краске «ЕА» (на основе красителей Эозин Y, светло-зеленый, и фосфовольфрамовой кислоты), которая служит протравой и обеспечивает дифференциальную окраску цитоплазмы разных клеток в розовый и зелёный цвет. После окраски в ЕА только кератинизированные клетки и чешуйки сохраняют жёлтый цвет, цитоплазма остальных клеток окрашивается в розовый и зелёный цвета.

Важно, что гематоксилин промывается проточной водой, а цитоплазматические красители фиксируются в спирте до и после окрашивания, что связано с различной растворимостью красителей, применяемых при окраске по Папаниколау. Причём, растворимость в воде у всех красителей существенно выше, чем в спирте. Спиртовая фиксация цитоплазматических красителей обеспечивает разную кинетику вымывания красителей и дает возможность разного окрашивания в цитоплазме в цитоплазме, фактически происходит поэтапное «вымещение» гематоксилинового красителя в цитоплазме. Своего рода многокомпонентность цитоплазмы обеспечивает главное преимущество окрашивания по Папаниколау – контрастность получаемого окрашенного микропрепарата для облегчения визуализации изменений в клетках.

Заканчивается приготовление препарата просветлением в ксилоле и заключением под покровное стекло или пленку.

Заключение в случае окрашивания по Папаниколау является обязательным этапом, поскольку клетки «выцветают» при взаимодействии с воздухом и цитологическая картина искажается, а препарат не подлежит оценке. В среднем покрытие необходимо провести в течение не более получаса с момента окрашивания. Покрытие может проводиться в вытяжном шкафу «ручным методом» (ксилол, монтирующая среда, покровное стекло) или на автоматических системах. Автоматическое покрытие бывает стеклом или пленкой. Для тонких качественных или монослойных препаратов покрытие пленкой предпочтительнее, так как пленка защищает стекло от случайных механических повреждений, обладает меньшей преломляемостью при микроскопии, сокращает ошибки сканирования с 1,5% до 0,1%, то есть в 15 раз при переходе от заключения под покровное стекло на пленку.

Технология окрашивания по Папаниколау имеет строгий многоэтапный протокол и ряд обязательных требований:

1. Тайминг на каждом этапе. Даже непродолжительная передержка стеклопрепарата в любом из реагентов ведет к потере образца и необходимости повторного взятия материала.
2. Фиксация при взятии биоматериала. Фиксация может осуществляться спиртовым спреем-фиксатором путем нанесения на мазок на стекле, погружением стекла в смесь Никифорова (спирт и эфир) или погружением образца в спирт при использовании метода жидкостной цитологии. Последний вариант фиксации наиболее целесообразен (тайминг на прием пациента, удобство работы в кабинете приема, 100% всего собранного материала попадет в лабораторию).
3. Покрытие стеклопрепарата после окрашивания. Окрашенное предметное стекло осветляется ксилолом или веществом, эквивалентным ксилолу, а затем покрывается покровным стеклом, поскольку в течение короткого времени цвет окрашенного микропрепарата искажается.

Проведение окрашивания по Папаниколау «ручным методом» увеличивает риски и % брака, имеет ограниченную производительность. Для выполнения скрининговых исследований (скрининг, массовое обследование населения) необходима автоматизация. Наиболее эффективным решением для автоматизации являются системы со встроенным протоколом окрашивания с проведением жидкостной цитологии. Единый протокол пробоподготовки и окрашивания обеспечивает полную стандартизацию, упрощает и ускоряет забор материала с влажной фиксацией, обеспечивает улучшение и облегчение пробоподготовки и окрашивания, получение качественного монослойного микропрепарата с высокой клеточностью в малом диагностическом окне, сокращение времени на просмотр и оценку стеклопрепарата, увеличение выявляемости патологических изменений, включая самые ранние незначительные проявления заболевания, а также признаки папилломавирусной инфекции, инфекционные агенты и пр.

С марта 2019г. в России в рамках Приказа Министерства здравоохранения №124н от 13.03.2019 «Об утверждении порядка проведения профилактического медицинского осмотра и диспансеризации определенных групп взрослого населения» в части Приложения №2 проводится скрининг на выявление злокачественных новообразований шейки матки, который включает в себя цитологическое исследование мазка с шейки матки 1 раз в 3 года у всех женщин в возрасте 18 -64 лет включительно. Цитологическое исследование проводится при окрашивании по Папаниколау, другие способы окраски не допускаются.

“По существу, цитологическое исследование по Папаниколау (Papanicolaou) является одним из методов окраски при микроскопическом исследовании и основано на различной реакции структур клеток на кислые и основные красители. Но несомненная заслуга Джорджа Папаниколау в том, что он впервые применил этот метод окраски и обосновал его значение для диагностики предраковых и раковых заболеваний шейки матки. В настоящее время Pap-test (названный в честь ученого) является основным методом диагностики для этого распространенного смертельного заболевания женщин ²”

Полезные статьи:

• Джордж Папаниколау (Ю. В. Цвелев, А. С. Иванов)

• Перевод таблиц из книги Bibbo Marluce, Wilbur David, «Всесторонняя цитопатология» (проф. Шабаловой И.П., к.м.н.Костючек И.Н.)
  

• Inception and Development of the Papanicolaou Stain Method (Nikolaos Chantziantoniou, Amber D. Donnelly, Maheswari Mukherjee, Mathilde E. Boon, R. Marshall Austin)
  

• Atlas of Exfoliative Cytology (George N. Papanicolaou, M.D., Ph.D., Clinical professor of anatomy emeritus, Cornell university medical college)

---

1. Улитина Е.П., Улитин И.Б., Бовыкина Г.А. Влияние факторов на заболеваемость щитовидной железы. Сборник научных трудов по итогам международной научно-практической конференции «Научные исследования в области медицины и фармакологии», № 2 . г. Саратов, 2017
2. И.П. Шабалова, К.Т. Касоян, Т.В, Жидкостная цитология: возможности, ограничения, перспективы, Москва, 2013г.