Возврат к списку

Окраска по Папаниколау (Пап-тест)

Окраска по Папаниколау (ПАП-тест, Pap-тест) – скрининговый метод обследования цервикального канала и шейки матки для обнаружения потенциально предраковых и опухолевых процессов. Тест был изобретен греческим ученым, врачом Георгиосом Папаниколау и назван в его честь.

В 1923 г. врач применил свою методику исследования на женщинах, начиная с собственной жены[4], изучая физиологию половых функций и в дальнейшем диагностику рака шейки матки.

Папаниколау получил американское гражданство в 1928 г. и в том же году последовало сообщение врача о разработанном им пап-тесте[4]. Его первое сообщение об использовании цитологического метода для анализа, при диагностике рака шейки матки, в 1928 г. было встречено с большим скептицизмом, поскольку господствующим тогда мнением было, что подобный диагноз возможен только при хирургическом вмешательстве.

Следующее сообщение врач опубликовал только в 1941 г., совместно с профессором гинекологии Herbert Traut[5]. В результате через 2 года последовала иллюстрированная монография (более 3 тыс. страниц), основанная на его исследовании.

Результаты исследования затронули в дальнейшем цитологические изменения при раке шейки матки и свои заключения врач опубликовал в 1943 году в специализированном издании под заголовком «Диагноз рака шейки матки при помощи мазков» (англ. Diagnosis of Uterine Cancer by the Vaginal Smear). Публикация этих работ вызвала огромный интерес мирового медицинского сообщества и немедленное опытное использование анализа врачами в разных медицинских учреждениях.

Ученый с результатами своих работ стал основателем нового научного ответвления услуг цитологии. Тест, получивший в его честь название Пап-тест, открыл широкие горизонты в медицинских исследованиях половой физиологии и эндокринологии, в особенности, при диагностике рака у женщин путем забора мазка.

Описываемая методика позволяет оценить степень созревания цитоплазмы, хорошо окрашивает ядра с атипией, что удобно для дальнейшего анализа. Образец для исследования может быть приготовлен как традиционным способом, так и путем жидкостной цитологии.

Анализ по Папаниколау является наилучшим для исследования гинекологических мазков, так как этот метод полихромный, он позволяет оценить степень созревания цитоплазмы (от сине-зеленого цвета в незрелых клетках до розового в зрелых и оранжевого с ороговением). Благодаря влажной фиксации хорошо сохраняются ядра, клеточная мембрана и структура хроматина. Краситель позволяет качественно дифференцировать степень созревания плоского эпителия и наличие патологического ороговения. Окрашивание контрастное, что в результате дает качественную визуализацию клинически значимых элементов при исследованиях в микроскопии. Однако, методика довольно сложна и многостадийна: в процессе подготовки препарата ткани подвергаются воздействию различных красок и технологических жидкостей, окраска структурных составляющих препарата – ядра и, в особенности, цитоплазмы, многократно изменяется.

“Метод жидкостной цитологии с окраской по Папаниколау позволяет лучше диагностировать опухолеподобные и опухолевые процессы, с формулировкой по классификации Bethesda четких и кратких диагнозов, что дает возможность назначать эффективные программы лечения. Результаты анализов с использованием пап-теста дают врачу-эндокринологу или врачу хирургу определить порядок дальнейших действий без сомнений¹”

Важно соблюдать протокол исследования, представленный производителем, поскольку пигмент многокомпонентный и может быть представлен 4-компонентным набором, 3-х компонентным или комбинированным с различной спиртовой основой.

Методика исследования включает в себя попеременное окрашивание красителями:

1. Гематоксилином Гарриса
2. В первой цитоплазматической краске OG6 (на основе оранжевого G), быстро прокрашивающей цитоплазму всех клеток
3. В комбинированной краске «ЕА» (на основе Эозина Y, светло-зеленого, и фосфовольфрамовой кислоты), которая служит протравой и обеспечивает дифференциальную окраску разных клеток в розовый и зелёный цвет. После окраски в ЕА только кератинизированные клетки и чешуйки сохраняют жёлтый цвет, цитоплазма остальных клеток окрашивается в розовый и зелёный цвета.

Важно, что гематоксилин промывается проточной водой, а цитоплазматические красители, применяемые для анализа, фиксируются в спирте до и после окрашивания, что связано с их различной растворимостью. Причём, растворимость в воде у них существенно выше, чем в спирте. Спиртовая фиксация цитоплазматических красителей обеспечивает разную кинетику их вымывания и дает возможность разного окрашивания в цитоплазме биоматериала, фактически в ней происходит поэтапное «вымещение» гематоксилинового красителя. Своего рода многокомпонентность цитоплазмы обеспечивает главное преимущество анализа – контрастность получаемого окрашенного микропрепарата для облегчения визуализации изменений.

Заканчивается приготовление препарата просветлением в ксилоле и заключением под покровное стекло или пленку.

Заключение в случае pap-теста является обязательным этапом, поскольку клетки «выцветают» при взаимодействии с воздухом и цитологическая картина искажается, а препарат не подлежит оценке. В среднем покрытие необходимо провести в течение не более получаса с момента пигментирования. Покрытие может проводиться в вытяжном шкафу «ручным способом» (ксилол, монтирующая среда, покровное стекло) или на автоматических системах. Автоматическое покрытие бывает стеклом или пленкой. Для тонких качественных или монослойных препаратов покрытие пленкой предпочтительнее, так как пленка защищает стеклянную поверхность от случайных механических повреждений, обладает меньшей преломляемостью при микроскопии, сокращает ошибки сканирования с 1,5% до 0,1%, то есть в 15 раз при переходе от заключения под покровное стекло на пленку.

Технология исследования по Пап- тесту имеет строгий многоэтапный протокол и ряд обязательных требований:

1. Тайминг на каждом этапе подготовки и проведении пап-теста. Даже непродолжительная передержка стеклопрепарата в любом из реагентов ведет к искажению результатов, потере образца и необходимости повторного взятия материала.
2. Фиксация при взятии биоматериала. Фиксация может осуществляться спиртовым спреем-фиксатором путем нанесения на мазок, погружением стекла с биоматериалом в смесь Никифорова (спирт и эфир) или погружением образца в спирт при использовании жидкостной цитологии. Последний вариант фиксации наиболее целесообразен (тайминг на прием пациента, удобство работы в кабинете приема, 100% всего собранного для анализа материала попадет в лабораторию).
3. Покрытие стеклопрепарата после окрашивания. Окрашенное предметное стекло осветляется ксилолом или веществом, эквивалентным ксилолу, а затем покрывается покровным стеклом, поскольку в течение короткого времени цвет окрашенного микропрепарата искажается.

Проведение такого анализа «ручным способом» увеличивает риски и % брака материала, имеет ограниченную производительность. Для выполнения скрининговых исследований (скрининг, массовое обследование населения) необходима автоматизация. Наиболее эффективным решением для автоматизации пап-теста являются системы со встроенным протоколом окрашивания с проведением жидкостной цитологии. Единый протокол пробоподготовки и пигментации обеспечивает полную стандартизацию анализа, упрощает и ускоряет забор материала с влажной фиксацией, обеспечивает улучшение и облегчение пробоподготовки и результатов пигментирования, получение качественного монослойного микропрепарата с высокой клеточностью в малом диагностическом окне, сокращение времени на получение информации о соскобе, просмотр и оценку стеклопрепарата, увеличение выявляемости патологических изменений, включая самые ранние незначительные проявления заболевания, а также признаки папилломавирусной инфекции, инфекционные агенты, инфекции, передающиеся половым путем и пр.

С марта 2019г. в России в рамках Приказа Министерства здравоохранения №124н от 13.03.2019 «Об утверждении порядка проведения профилактического медицинского осмотра и диспансеризации определенных групп взрослого населения» в части Приложения №2 проводится анализ на выявление злокачественных новообразований шейки матки, который включает в себя цитологическое исследование мазка с шейки матки 1 раз в 3 года у всех женщин в возрасте 18 -64 лет включительно. Исследование проводится при окрашивании по Пап- тесту, другие способы окраски не допускаются.

“По существу, цитологическое исследование по Папаниколау (Papanicolaou) является одним из методов окраски при микроскопическом исследовании. Анализ основан на различной реакции структур клеток на кислые и основные красители. Но несомненная заслуга Джорджа Папаниколау в том, что он впервые применил этот метод анализа и обосновал его значение для диагностики предраковых и раковых заболеваний шейки матки. В настоящее время Pap-test (названный в честь ученого) является основным методом диагностики для этого распространенного смертельного заболевания женщин ²”

Полезные статьи:

• Джордж Папаниколау (Ю. В. Цвелев, А. С. Иванов)

• Перевод таблиц из книги Bibbo Marluce, Wilbur David, «Всесторонняя цитопатология» (проф. Шабаловой И.П., к.м.н.Костючек И.Н.)
  

• Inception and Development of the Papanicolaou Stain Method (Nikolaos Chantziantoniou, Amber D. Donnelly, Maheswari Mukherjee, Mathilde E. Boon, R. Marshall Austin)
  

• Atlas of Exfoliative Cytology (George N. Papanicolaou, M.D., Ph.D., Clinical professor of anatomy emeritus, Cornell university medical college)

---

1. Улитина Е.П., Улитин И.Б., Бовыкина Г.А. Влияние факторов на заболеваемость щитовидной железы. Сборник научных трудов по итогам международной научно-практической конференции «Научные исследования в области медицины и фармакологии», № 2 . г. Саратов, 2017
2. И.П. Шабалова, К.Т. Касоян, Т.В, Жидкостная цитология: возможности, ограничения, перспективы, Москва, 2013г.