Возврат к списку

Иммуногистохимия (ИГХ). Этапы исследования

Наибольшее значение метод ИГХ имеет в диагностике опухолей, так как позволяет уточнить гистогенез новообразования, способствует выявлению прогностических и предиктивных параметров. На основании результатов диагностики путем ИГХ исследования врачами планируется лечебная тактика в отношении опухоли у пациента, в том числе решается вопрос о наличии показаний к назначению таргетной терапии. Это играет существенную роль в постановке диагноза, позволяет врачу своевременно и правильно назначать лечение пациенту, а также следить за динамикой патологического процесса. Иммуногистохимия - это метод анализа клеток и тканей с использованием антител.

Материалом для иммуногистохимического исследования (ИГХ) служит ткань, полученная в результате забора материала у пациента (биопсия, операционный материал и т.д), т.е. парафиновый срез на предметном стекле. Ткань пациента подвергается стандартной гистологической обработке и проходит все этапы анализа: взятие материала, вырезка, фиксация в 10% забуференном формалине, проводка, заливка в парафин, микротомирование, монтирование среза на предметное стекло. Также возможны исследования на замороженных срезах (крио-срезах) и на клеточном материале. Специалисты медицинской лаборатории проводят подготовку образцов и описание биологических структур с помощью иммуногистохимических анализов.

Иммуногистохимическое окрашивание (ИГХ) состоит из нескольких этапов:

1. Депарафинизация и регидратация среза

Депарафинизация - процесс гидратации (насыщения водой) фрагмента ткани и замещения парафина водной составляющей. Депарафинизация образца является стандартной рутинной процедурой в гистологической лаборатории. Исследование включает в себя стадии обработки парафинового среза ксилолом и спиртом для того, чтобы антитела проникали в ткань и связывались с антигенными эпитопами. В настоящее время возможно проведение депарфинизации с использованием специальных буферов.

2. Демаскировка

В процессе фиксации тканевые антигены претерпевают конформационные изменения, связанные с коагуляцией белков и образованием перекрестных сшивок при воздействии альдегидов. Эти изменения приводят к маскировке антигенов ткани и делают их недоступными для антител.

Демаскировка - процесс восстановления антигенной активности ткани, которая изменилась в ходе фиксации образца. Механизмом демаскировки является разрушение метиленовых мостиков (-СH2-) в белках.

Демаскировка бывает 2х видов:

• Высокотемпературная, происходит с использованием специальных буферов для демаскировки с различным pH (ЭДТА и Цитратный буферы)

• Протеолитическая, происходит с использованием ферментов (протеаз)

Из оборудования для этапа демаскировки необходимы водяная баня либо скороварка, а также контейнеры с держателями для стекол.

3. Промывка среза

Промывка необходима для удаления остатков реагентов со среза. Существуют и применяются специальные буферы для промывки, по составу они бывают фосфатно-солевыми (PBS) либо трис (TBS). Часто в своем составе они содержат Tween-20, который способствует более эффективной промывке среза, в результате чего снижается неспецифическое фоновое окрашивание образца.

4. Блокировка

Этап необходим для блокирования эндогенной пероксидазы, находящийся в ткани, и устранения неспецифического связывания реагентов с тканевыми компонентами перед нанесением первичного антитела. Для этого применяются блокирующие растворы (Peroxide Block). Обычно они состоят из 0.3% раствора перекиси водорода (H2O2) с добавлением азида натрия в качестве консерванта.

Механизм действия ИГХ - перекись водорода связывает эндогенную пероксидазу, и она не выступает в качестве субстрата для пероксидазы хрена на этапе визуализации антигена. Результатом анализа служит отсутствие неспецифического и фонового окрашивания среза.

5. Нанесение первичного антитела

Первичные антитела являются основным реагентом в иммуногистохимическом исследовании при постановке иммуногистохимической реакции. Это обусловлено их способностью к высоко специфичному связыванию с антигеном, вызвавшим их образование. Степень связывания зависит от особенностей свойств и структуры молекул.

Антитело во время исследования связывается не со всем антигеном, а с его определенным участком – эпитопом. По популяции антитела можно разделить на гетерогенную и гомогенную, а по своей специфичности к эпитопам – на поликлональные антитела и моноклональные антитела.

Поликлональные антитела - гетерогенная смесь антител, направленных против различных эпитопов одного и того же антигена. Антитела образуются различными клонами В- клеток животного и, как следствие, имеют различные иммунохимические свойства. В силу своей мультиклональности при анализе могут узнавать множество эпитопов на одной белковой молекуле, т.е. обладают высокой чувствительностью, однако специфичность у поликлональных антител ниже.

Моноклональные антитела - гомогенная популяция иммуноглобулинов, направленных против одного эпитопа. Антитела образуются одним клоном В-клеток одного животного и поэтому являются сходными по иммунохимическим свойствам. Обладают высокой специфичностью, однако чувствительность у моноклональных антител ниже.

Первичные антитела по формату могут быть концентрированные – их необходимо разводить в специальном разбавителе для антител и готовые к применению (Ready-to-Use, RTU) - не требуют разведения и сразу готовы к нанесению на срез. По сравнению с концентрированными антителами, готовые к применению (RTU) антитела имеют более короткий срок годности.

Информация о pH буфера для демаскировки, диапазоне разведений, времени и температуре инкубации с первичными антителами содержится в инструкциях от производителя к первичным антителам.

6. Визуализация антигена

Выявление антигена в ткани может проводится прямым методом (иммунофлуоресценция) либо непрямым методом (ферментативная реакция).

В иммунофлуоресценции применяют первичные антитела, меченные флуоресцентными красителями. Данный метод исследования позволяет обнаружить поверхностные антигены, а также определить их точную локализацию. Визуализация результатов реакции проводится с использованием флуоресцентного микроскопа.

Гораздо более популярным методом исследования является хромогенная визуализация результатов реакции. В данном случае оценка производится в светлом поле классического микроскопа и не требует дополнительного оборудования.

Механизм хромогенной визуализации антигена лежит реакция с участием фермента и его субстрата, с последующим образованием окрашенного продукта под воздействием хромогена.

Данный метод исследования состоит из нескольких этапов. После инкубации с неконъюгированными первичными антителами наносят вторичные антитела, меченные ферментом (систему детекции). Далее срез обрабатывают раствором субстрата и хромогена, чтобы фермент, субстрат и хромоген вступили в реакцию. В результате ферментативной реакции получается продукт реакции - окрашенный осадок, который осаждается в месте локализации искомого антигена в ткани, придавая срезу окраску.

В зависимости от выбора фермента, которым мечены вторичные антитела , и хромогена, можно получить различную окраску среза.

• DAB - 3,3’Diaminobenzidine (диаминобензидин): вступает в специфическую реакцию с HRP (пероксидаза хрена); результат реакции – темно-коричневый

• AEC (амино-этил-корбазол): вступает в специфическую реакцию с HRP (пероксидаза хрена); результат реакции – красный; чувствителен к органическим растворителям, требует заключения в водорастворимую монтирующую среду

• FAST RED/Permanent Red (прочный красный): вступает в специфическую реакцию с AP (щелочная фосфатаза); результат реакции – ярко-красный; чувствителен к органическим растворителям, требует заключения в водорастворимую монтирующую среду

7. Подкраска и заключение 

Заключительным этапом иммуногистохимического окрашивания (ИГХ) является подкраска препарата гематоксилином для лучшей ориентации в препарате, а также заключение препарата под покровное стекло либо пленку.

Иммуногистохимическое исследование важно для диагностики, определения факторов заболеваний, включая генетические и опухолевые патологии, помогает врачам проводить анализ и прогнозировать лечение злокачественных опухолей и заболеваний.